技术简介

实时荧光定量PCR（Real Time – PCR，简称RT-PCR，也简称qPCR）是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质，利用荧光信号积累实时监测PCR扩增产物并进行定量分析的方法。根据所用荧光化学物质的不同，qPCR可分为荧光染料法（SYBR Green Ⅰ法为代表）和荧光探针法（TaqMan法为代表）。

SYBR Green Ⅰ染料法因具有使用简便，价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性，即染料可以与任何dsDNA结合。因此，qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值，影响定量结果的准确性，而TaqMan探针法的出现很好地解决了染料法非特异性的问题。下面，我们一起来了解一下TaqMan探针法qPCR的基本原理及其主要应用。

TaqMan探针法qPCR原理

TaqMan探针法qPCR是使用TaqMan荧光探针进行荧光检测的方法。其基本原理是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶的5-3核酸外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到检测PCR产物扩增量的目的。

图. TaqMan水解探针作用机理图

TaqMan探针法qPCR优点

 1   特异性高、定量准确

从原理可以看出，荧光探针只与目的序列结合，理论上探针法的荧光信号只来源于目的序列，即不受非特异性产物的影响，因此，TaqMan探针法qPCR的特异性非常高，定量准确。

 2   实验耗时短

因探针法qPCR的高特异性，故无需再设置熔解曲线检测扩增产物的特异性如何，大大缩短了实验时间。

 3   兼容多重反应

不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，因此可以在同一个反应体系中利用不同荧光标记的探针同时检测多个靶标，达到节省实验成本的目的。

TaqMan探针法qPCR主要应用

正是由于上述优点，TaqMan探针法qPCR已被广泛地应用于科学研究和生产实践之中。有基础生物学研究、食品检测、医学检测与诊断等,尤其是在医学检测和诊断方面得到了大力地推广。

当在进行扩增前加入RNA反转录操作或者过程的话，则则相应检测方法就称为反转录qPCR，可以用来进行RNA病毒的检测。

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