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亲,您用的反转录酶「热稳定性」好不好?
来源:华葵金配 | 作者:cnpair | 发布时间: 2022-11-15 | 139 次浏览 | 分享到:
华葵金配提供的反转录酶(货号P100305和P100306)是行业中热稳定性非常好的反转录酶,自推出以来备受好评,已被多家分子诊断试剂厂家采用。该反转录酶特异性佳,扩增效率高,极大提高了分子诊断产品最终性能。

反转录反应温度较高有利于减少RNA二级结构对引物结合效率的影响,随之而来是对反转录酶的热稳定性提出更高的要求。目前,不少试剂厂商在实际开发过程中都因反转录酶的热稳定性差导致产品性能不佳而头疼。


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扩展阅读:反转录酶二三事


反转录酶(reverse transcriptase,也可写成逆转录酶),又称为依赖RNA的DNA聚合酶。1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶,该酶以RNA为模板,根据碱基配对原则,按照RNA的核苷酸顺序(其中U与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反,故称为反转录,催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶。后来发现反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中,哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。



原理


反转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)合成互补DNA(cDNA)的酶。该酶以RNA为模板,以dNTP为底物,tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物,在tRNA3'-OH末端上,根据碱基配对的原则,按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链,这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA,cDNA)。



反转录酶主要包括以下几种活性:

①RNA依赖的DNA聚合酶活性;

②核糖核酸酶(RNase)活性;

③DNA依赖的DNA聚合酶活性。

此外,也因为反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。



应用


01
反转录聚合酶链式扩增反应(RT-PCR)

反转录PCR又称为逆转录PCR,是将RNA的反转录过程和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术,是目前应用最广泛的RNA检测方法,其原理如下图所示。



由于在聚合酶链式反应中引物之间会发生反应,即引物和引物之间会发生非特异性反应。SYBRGreenI会嵌插在双链中,从而产生非特异性。因此,1996年MORRIS等在PCR反应体系中利用Taq Man探针来检测扩增产物,反应原理如上图所示。


02
依赖核酸序列的扩增(NASBA)

1991年,Cangen公司发明了一种不需要热变性的恒温检测方法——依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)。检测原理如下图所示。该技术不需要利用PCR仪器。反应中需要3种酶(反转录酶,T7 RNA聚和酶和RNase H)的参与。

NASBA应用于多方面,尤其是对RNA病毒的检测。目前,我国发布的关于检测禽流感病毒的标准中,NASBA已经成为检测标准方法之一(GB/T19440-2004禽流感病毒NASBA检测方法)。


03
反转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)

2000年,NOTOMI等发明了一种检测核酸的方法叫做环介导等温扩增方法(LAMP)。KELLY等人在此基础上开发出(RT-LAMP)进行HIV检测,其原理如下图所示。

该方法反应时间≤60min,对仪器设备要求低,一台水浴锅或恒温箱就能实现反应,可以检测低至10~100个拷贝的RNA分子。同时,RT-LAMP可以直接利用血液或血浆作为检测样本,去掉了繁杂的核酸提取步骤使整个反应不超过60min。



RNA检测注意事项

模板RNA

模板RNA至少应保证全长并且不含反转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。同时要特别防止RNase的污染。



RNase抑制剂

RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中,在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入,从而有效抑制RNA的降解。


引物

引物设计质量影响RT的结果,建议根据不同引物退火温度进行RNA扩增反应温度的摸索设计。


反转录酶

成功的cDNA合成来自高质量的反转录酶,高质量的反转录酶特异性好、稳定性好且扩增效率高。


参考:

RNA检测方法研究新进展_张攀松 2017

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